Бисера из белка


Белочка. | Страна Мастеров

Белочка в технике объемного паралельного плетения. Это мое творение. Белочка была придумана мною несколько лет назад. Решила сделать очень подробный мастер-класс. Надеюсь, что вам понравится)

Материалы - 1 красная бусина, по 2 штучки черного и коричневого бисера, оранжевый и белый бисер, проволока (0,3 мм) - 110-115см.
Бисер должен быть среднего размера.

Набрать на один конец проволоки красную бусину и три оранжевых бисерин. Другой конец проволоки протянуть через три оранжевых (бусину пропустить)
Одна красная бусина - это первый ряд белочки (нос). Три оранжевых - второй ряд.

Подровнять кончики проволоки, чтобы была одинаковая длинна и аккуратно затянуть.

Набрать три белых на один конец проволоки, а другой конец проволоки протянуть через все три бисеринки.

Затянуть проволоку так, чтобы белые бисеринки оказались под оранжевыми. Это будет второй нижний ряд.

Третий верхний ряд. Набираем 1 оранжевую, 1 черную, 2 белых, 1 черную и 1 оранжевую. Второй конец проволоки протянуть через все бисеринки (6 штук). Затянуть.

Третий нижний ряд состоит из 4 белых бисерин. Набираем на один конец, протягиваем другим и затягиваем.

Четвертый верхний ряд. На один конец проволоки набираем 4 оранжевых и 1 коричневую бисеринку. Коричневую пропускаем и протягиваем проволоку в соседнюю оранжевую бисеринку.

Надо хорошо затянуть проволоку. Пальцами придерживайте бисеринки, прижимая их к голове белочки. Бисеринки не должны болтаться на проволоке.

Тоже самое сделайте в другой стороны.

На один конец проволоки наберите 1 оранжевую и 2 белых, а на другой - только 1 оранжевую.

Тот конец проволоки, где была 1 оранжевая, протянуть через 2 белые бисеринки и затянуть.

Пропустить три оранжевых бисеринки (ушки) и протянуть через 2 крайние оранжевые.

Тоже самое сделать с другой стороны. Аккуратно затянуть проволоку. Не позволяйте проволоке заламываться.

Пятый верхний ряд состоит из 4 оранжевых бисерин. Подтянуть их повыше к голове и ушкам.

Пятый нижний ряд. Набрать 3 белые бисерины и затянуть их под 5 верхний ряд.

Шестой верхний ряд - 2 оранжевых бисерины. Нижнего ряда нет.

Седьмой верхний ряд - 2 оранжевых бисерины. Расположите их рядом (на той же линии) с шестым верхним рядом.

Седьмой нижний ряд - 2 белые бисеринки. Затяните поближе к бисеринам нижнего ряда.

Восьмой верхний ряд - 3 оранжевые бисерины.

На один конец проволоки набрать 3 оранжевых и 3 белых бисерин.

Пропустить 3 белых и протянуть проволоку через 3 оранжевых.

С другой стороны проделайте тоже самое. Аккуратно затяните проволоку. Передние лапки готовы.

Восьмой нижний ряд - 2 белые бисерины

Девятый верхний ряд - 4 оранжевые бисерины.

Девятый нижний ряд - 3 белые бисерины.

Десятый верхний ряд - 5 оранжевых бисерин.

Десятый нижний ряд - 4 белые бисерины.

11 верхний ряд - 6 оранжевых бисерин.

11 нижний ряд - 5 белых бисерин.

12 верхний ряд - 6 оранжевых бисерин.

На один конец проволоки набрать 4 оранжевых и 3 белых бисерин. Три белых пропустить и протянуть через 4 оранжевых.

С другой стороны проделайте тоже самое. Аккуратно затяните проволоку.
Задние лапки готовы.

12 нижний ряд - 5 белых бисерин.

13 ряд. Начинаем делать хвост - 3 или 4 оранжевых бисерины (у меня крупные попались)

14 ряд. На один конец проволоки набрать 1 оранжевую бисерину, а на другой - 5 оранжевых.

Ту проволоку, на которую набрали 1 бисеринку протянуть через 4 оранжевых.

Затянуть проволоку.

15 ряд - 5 оранжевых бисерин.

Вид сбоку. Хвост состоит только из верхних рядов (плоское плетение)

16 ряд. На оба конца проволоки набрать по 2 оранжевых бисерины.

На один конец проволоки набрать еще 2 бисерины, а другой конец проволоки протянуть через эти 2 бисерины. Несильно затянуть.

Протянуть оба конца проволоки через две центральные бисерины 11 ряда.

Теперь нужно вернуться в 16 ряд. Протяните проволоку через 2 крайние бисерины с друх сторон.

16 ряд. Вид сзади.

Вид сбоку.

17 ряд. Набрать на обе проволоки по 3 оранжевых, потом добрать еще 1 и протянуть другим концом проволоки через нее. Несильно затянуть.

Протянуть оба конца проволоки через центральную бисерину 10 ряда.

Нужно вернуться в 17 ряд. Протяните проволоку через три крайние бисеринки с двух сторон.

Вид сбоку.

18 ряд - 8 оранжевых бисерин.

19 ряд - 7 оранжевых бисерин.

20 ряд - 6 оранжевых бисерин.

Вид сбоку.

21 ряд - 5 оранжевых бисерин.

22 ряд - 4 оранжевых.
23 ряд - 3 оранжевых.

24 ряд - 2 белые бисерины, 25 ряд - 2 белые бисерины, 26 ряд - 1 белая бисерина. Хвостик готов. Закрепите проволоку. Подровняйте хвостик, лапки и все остальное.

Белочка готова. Вид спереди.

Вид сзади.

Подружки)
Спасибо всем, кто зашел посмотреть на белочку)

Protein A / G Магнитные бусины | Thermo Fisher Scientific

Магнитные шарики Thermo Scientific Pierce Protein A / G обеспечивают эффективную иммунопреципитацию (IP), коиммунопреципитацию (co-IP) и очистку антител с высокой чистотой и низким уровнем фона. Эти уникальные частицы размером 1 мкм состоят из полимерного ядра, покрытого двумя слоями магнетита и запечатанного блокирующим агентом для уменьшения неспецифического связывания (Таблица 1; Рисунок 1).Поверхность гранул соединена с рекомбинантным белком A / G, который объединяет IgG-связывающие домены как белка A, так и белка G. Белок A / G обеспечивает захват иммуноглобулинов из более широкого диапазона видов и изотипов антител, чем белок A или белок. G один. Гранулы можно использовать как вручную с магнитной подставкой, так и с автоматическими платформами, такими как Thermo Scientific KingFisher Instruments.

Таблица 1.Характеристики магнитных шариков Thermo Scientific Pierce Protein A / G

Состав Заблокированные частицы оксида железа, ковалентно покрытые монослоем белка A / G
Диаметр 1 мкм
Концентрация 10 мг / мл
Переплет 55-85 мкг кроличьего IgG / мг магнитных частиц
88802-ProteinAGMag-001-469px

Рисунок 1.Схема магнитных шариков Thermo Scientific Pierce Protein A / G.

Магнитные шарики Pierce Protein A / G могут использоваться для очистки антител от биологических жидкостей, таких как сыворотка. По сравнению с магнитными шариками с протеином A и протеином G от других поставщиков, магнитные шарики Pierce A / G очищают значительно больше антител из кроличьей (рис. 2A) и мышиной (рис. 2B) сыворотки с меньшим фоном.Кроме того, магнитные шарики Pierce A / G обладают в четыре раза большей связывающей способностью (на миллиграмм шариков) для очищенного кроличьего IgG, чем магнитные шарики от другого поставщика (рис. 3).

88802-ProteinAGMag-002-stacked

Рисунок 2. Выделите больше IgG из кроличьей и мышиной сыворотки с меньшим фоном.Используя KingFisher Flex с 96-луночным планшетом с глубокими лунками, IgG очищали из кроличьей (панель A) и мыши (панель B) сыворотки (5 мг общего белка) с использованием 50 мкл магнитных шариков Pierce Protein A / G и магнитных шариков с белками A и G. бусы от других поставщиков. Гранулы промывали трис-забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% детергента Tween 20 (TBST), инкубировали 1 час с сывороткой, разбавленной в TBST, промывали трижды и элюировали 0,1 М глицином, pH 2,8, в течение 10 минут при комнатной температуре. Элюаты разделяли с помощью SDS-PAGE и окрашивали красителем Thermo Scientific Imperial Protein Stain (кат.№ 24615). Полосы тяжелой цепи IgG количественно определяли денситометрией. Значения для каждого набора повторяющихся полос усредняли и выражали как процент от среднего для гранул Pierce Protein A / G.

88802-ProteinAGMag-003-455px

Рисунок 3.Связывающая способность кроличьих IgG магнитных шариков Thermo Scientific Pierce Protein A / G примерно в четыре раза выше, чем у магнитных шариков от ведущего поставщика. Магнитные гранулы Pierce Protein A / G и магнитные гранулы Protein A и Protein G от другого поставщика добавляли в 96-луночный планшет (гранулы по 1 мг на лунку). Используя прибор KingFisher 96, шарики промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,05% детергента Tween 20 (PBST), и инкубировали в течение 1 часа с различными количествами очищенного кроличьего IgG (20-200 мкг).После связывания шарики трижды промывали PBST и элюировали при 96 ° C восстанавливающим буфером для образцов SDS-PAGE. Связывание рассчитывали путем вычитания количества протеина в проточном потоке из загруженного количества с использованием анализа протеина BCA Thermo Scientific Pierce (каталожный номер 23225).

Набор Pierce Classic Magnetic IP / Co-IP Kit обеспечивает эффективную иммунопреципитацию целевого белка из клеточных лизатов (рис. 4).Этот набор также может эффективно изолировать интактные белковые комплексы и белки co-IP, которые связаны с целевым белком. Например, IP Cdk1 будет совмещать с IP циклином B, если ячейки синхронизированы в поздней фазе G2. Магнитные шарики Pierce Protein A / G коиммунопреципитировали циклин B из клеточного лизата U2OS с таким же или более высоким выходом, чем шарики с протеином A и G от других поставщиков (рис. 5A). Окрашивание серебром элюатов гранул выявило незначительный фон (за исключением антител) для всех тестируемых гранул (рис. 5В).

88804-ProteinAGMag-004-467px

Рис. 4. Набор Thermo Scientific Pierce Classic Magnetic IP / Co-IP Kit эффективно иммунопреципитирует Cdk1. Клетки U2OS (остеосаркомы человека) синхронизировали в поздней фазе G2 путем сывороточного голодания с последующим ростом в 20% фетальной бычьей сыворотке в течение 18 часов до сбора урожая.Клетки лизировали в буфере для лизиса / промывки IP, и 0,75 мг лизата (на образец) инкубировали с антителом против Cdk1 и без него в течение ночи при 4 ° C. Магнитные гранулы Pierce Protein A / G и магнитные гранулы Protein A и Protein G от трех поставщиков добавляли (по 50 мкл каждый) в 96-луночный планшет. Используя прибор KingFisher Flex, шарики промывали буфером для лизиса / промывки IP, инкубировали в течение 1 часа со смесью образец антиген / антитело, дважды промывали буфером для лизиса / промывки IP, содержащим 0,5 M NaCl, один раз промывали водой и элюировали SDS. -PAGE восстанавливающий буфер для образца в течение 10 минут при комнатной температуре.Элюаты разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали вестерн-блоттингом на Cdk1. Магнитные шарики Pierce Protein A / G были способны эффективно IP Cdk1 с более высоким выходом, чем шарики от других поставщиков.

88804-ProteinAGMag-006-483px

Рис. 5. Набор для магнитного IP / Co-IP от Thermo Scientific Pierce Classic эффективно коиммунопреципитирует циклин B и Cdk1.Клетки U2OS синхронизировали, и образцы готовили, как описано на фиг. 3. Элюаты разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали вестерн-блоттингом (панель A) на циклин B или окрашивание серебром (панель B). Гранулы Pierce Protein A / G были способны эффективно взаимодействовать с IP-циклином B с выходами, превышающими или равными гранулам от других поставщиков. Бусины Pierce связывали такое же или большее количество антител, чем магнитные бусины с протеином A и G от других поставщиков (панель B). Все бусины имели незначительное неспецифическое связывание.

.

Продукты Dynabeads для иммунопреципитации | Thermo Fisher Scientific

Шаг 1: Связывание антитела с шариками

Связывание антитела с шариками. Магнитные шарики Dynabeads предварительно покрыты протеином A, протеином G, антителами против мышиного IgG или кроличьего IgG, и благодаря быстрой кинетике они связывают добавленные антитела всего за 10 минут. Биотинилированные антитела также можно использовать в сочетании со стрептавидином Dynabeads.Один раз промойте шарики на магните, чтобы удалить несвязанные антитела.

Шаг 2: Добавьте образец к бусинам

Добавьте образец к бусинам. Добавьте белок, содержащий образец, к промытым шарикам со связанным антителом и инкубируйте еще 10 минут для связывания целевого белка, представляющего интерес. Если белок имеет низкое содержание или низкое сродство, инкубацию можно увеличить до 1 часа или до инкубации в течение ночи; но в целом достаточно 10-минутной инкубации.

Шаг 3. Промойте связанные с белком шарики

Вымойте связанные с белком шарики. Для обеспечения высокой чистоты связанного целевого белка шарики необходимо 2–4 раза промыть буфером на магните для удаления всех несвязанных белков. Эффективный процесс изоляции обеспечивает высокое отношение сигнал / шум.

Шаг 4: элюируйте белок

Элюируйте белок. При необходимости белок можно элюировать с гранул, используя либо процедуру мягкого элюирования, либо процедуру денатурирующего элюирования (подробности см. В описании элюирования ниже).

.

Протокол иммунопреципитации (IP) | Abcam

Иммунопреципитация - это метод, позволяющий очистить белок. Антитело к интересующему белку инкубируют с клеточным экстрактом, позволяя антителу связываться с белком в растворе. Затем комплекс антитело / антиген извлекают из образца с использованием агарозных гранул, связанных с белком A / G. Это изолирует интересующий белок от остальной части образца. Затем образец можно разделить с помощью SDS-PAGE для вестерн-блоттинга.

Содержание



Буферы для лизиса

Идеальный буфер для лизиса минимизирует денатурацию белка при высвобождении достаточного количества белков из образца. Неионные детергенты, такие как NP-40 и Triton X-100, менее агрессивны, чем ионные детергенты, такие как SDS и дезоксихолат натрия. Другие переменные, которые могут влиять на успех иммунопреципитации, включают концентрацию соли, концентрацию двухвалентных катионов и pH. Чтобы оптимизировать переменные, они должны быть протестированы в следующих диапазонах (из Харлоу и Лейн, стр. 231):

  • Соли: 0–1 M
  • Неионогенное моющее средство: 0.1–2%
  • Моющее средство, ионное: 0,01–0,5%
  • Двухвалентные катионы: 0–10 мМ
  • ЭДТА: 0–5 мМ
  • pH: 6–9


Неденатурирующий буфер для лизиса

Применение для антигенов, растворимых в детергенте и распознаваемых антителом в нативной форме. Тритон Х-100 может быть заменен НП-40.

  • 20 мМ Tris HCl pH 8
  • 137 мМ NaCl
  • 1% Nonidet P-40 (NP-40)
  • 2 мМ EDTA

Хранить до 6 месяцев при 4 ° C.Непосредственно перед употреблением добавить ингибиторы протеаз.

Для удобства можно приготовить 10% исходный раствор дезоксихолата натрия (5 г на 50 мл). Его необходимо беречь от света.

Буфер для лизиса растворимого белка, не содержащий детергентов

Некоторые растворимые белки могут не требовать использования детергентов. Используйте этот буфер для механического лизиса клеток, например, для гомогенизации с помощью гомогенизатора Даунса.

PBS, содержащий:

  • 5 мМ ЭДТА
  • 0.02% азид натрия

Хранить до 6 месяцев при 4 ° C. Непосредственно перед употреблением добавить ингибиторы протеаз.

Денатурирующий лизисный буфер для растворимых антигенов, не содержащих детергентов

Эпитопы нативных белков недоступны для антител, которые распознают только денатурированные белки. При сборе и лизировании клеток нагрейте клетки в денатурирующем буфере для лизиса. Этот метод также можно использовать для антигенов, которые нельзя извлечь из клетки неионными детергентами.Использование ДНКазы1 будет способствовать извлечению белков из хроматина.

Хранить до 1 недели при комнатной температуре.

Непосредственно перед использованием добавьте

  • 10 мМ дитиотреитола или бета-меркаптоэтанола
  • Ингибиторы протеаз 15 Ед / мл DNase1

Промывочные буферы

  • 10 мМ Трис; довести pH до 7,4
  • 1 мМ ЭДТА
  • 1 мМ EGTA; pH 8,0
  • 150 мМ NaCl
  • 1% Triton X-100
  • 0,2 мМ ортованадат натрия
  • Смесь ингибиторов протеазы


Хранить до 6 месяцев при 4 ° C.Непосредственно перед употреблением добавить ингибитор протеазы.



Другие реагенты


Ингибиторы протеаз

Протеолиз, дефосфорилирование и денатурация начинаются сразу после лизирования клеток. Помещение образцов на лед замедлит эти процессы, но также доступны коктейли из ингибиторов протеаз и фосфатаз. Если коктейль не используется, PMSF (50 мкг / мл) и апротинин (1 мкг / мл) являются ингибиторами протеазы, обычно используемыми для иммунопреципитации.

Прочие реагенты

  • Стерильный PBS pH 7.4
  • Стерильный PBS-BSA 1% мас. / Об. (Профильтрованный)
  • Буфер TBST
  • Буфер для загрузки / образца для вестерн-блоттинга
  • VeriBlot для иммунопреципитации вторичных антител, которые предпочтительно обнаруживают невосстановленное, неденатурированное первичное антитело во время вестерн-блоттинг.
  • 100 мМ исходный раствор EDTA получают из 1,86 г EDTA, растворенного в 40 мл воды. Добавьте NaOH, чтобы довести pH до 7,4. Наконец, доведите общий объем до 50 мл.


Подготовка лизатов


Лизаты из клеточной культуры (неденатурирующие)

  1. Поместите чашку для культивирования клеток на лед и промойте клетки ледяным PBS.
  2. Слить PBS, затем добавить ледяной буфер для лизиса (1 мл на 107 клеток / 100 мм2 чашку / 150 см2 колбу; 0,5 мл на 5x106 клеток / 60 мм2 чашку или 75 см2 колбу).
  3. Соскребите прилипшие клетки с чашки с помощью холодного пластикового скребка для клеток, затем осторожно перенесите суспензию клеток в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку.
  4. Поддерживайте постоянное перемешивание в течение 30 минут при 4 ° C.
  5. Центрифуга в микроцентрифуге при 4 ° C.

    Вам может потребоваться изменить силу и время центрифугирования в зависимости от типа ячейки.Рекомендуемое значение - 20 минут при 12000 об / мин, но вы должны оптимизировать это для вашего конкретного эксперимента (например, лейкоцитам необходимо очень легкое центрифугирование).

  6. Осторожно извлеките пробирки из центрифуги и поместите на лед. Аспирируйте супернатант и поместите в свежую пробирку, оставленную на льду, и выбросьте осадок.

Лизаты из культуры клеток (денатурирующие)

  1. Добавьте 100 мкл денатурирующего буфера для лизиса к 0,5–2x107 клеток.
  2. Хорошо перемешайте, энергично встряхивая в течение 2–3 секунд на максимальной скорости.Перенести суспензию клеток в пробирку для микроцентрифуги.

    На этой стадии раствор может быть вязким из-за высвобождения ДНК.

  3. Нагрейте образцы до 95 ° C в течение 5 минут до денатурирования.
  4. Разбавьте суспензию 0,9 мл неденатурирующего буфера для лизиса. Осторожно перемешайте.

    Избыток 1% Triton X-100 в неденатурирующем буфере для лизиса гасит SDS в исходном денатурирующем буфере.

  5. Фрагментируйте ДНК, пропуская лизированную суспензию 5–10 раз через иглу, прикрепленную к шприцу на 1 мл.

    Повторяйте механическое прерывание, пока вязкость не снизится до приемлемого уровня. Если ДНК не полностью переварена и фрагментирована, это может помешать разделению осадка и супернатанта после центрифугирования .

  6. Инкубируйте на льду 5 мин.
  7. Выполните иммунопреципитацию

Лизаты из ткани

  1. Рассеките ткань чистыми инструментами и как можно быстрее. По возможности делайте это на льду, чтобы предотвратить разложение протеазами.
  2. Поместите ткань в микроцентрифужные пробирки с круглым дном и погрузите в жидкий азот для быстрого замораживания. Храните образцы при -80 ° C для дальнейшего использования или на льду для немедленной гомогенизации.
  3. Для образца ткани массой ~ 5 мг быстро добавьте в пробирку ~ 300 мкл лизирующего буфера и гомогенизируйте с помощью электрического гомогенизатора.
  4. Промойте лезвие дважды еще одним 300 мкл буфера для лизиса на одно полоскание, а затем поддерживайте постоянное перемешивание в течение 2 часов при 4 ° C (например, поместите на орбитальный шейкер в холодильник).

    Объемы буфера для лизиса должны определяться в зависимости от количества присутствующей ткани. Белковый экстракт не должен быть слишком разбавленным, чтобы избежать потери белка и минимизировать объем образца для загрузки в гели. Минимальная концентрация - 0,1 мг / мл; оптимальная концентрация - 1–5 мг / мл.

    Если требуются денатурированные образцы, используйте денатурирующий лизисный буфер и выполните шаги 2–5 из описанного выше протокола денатурирования.

  5. Центрифуга в течение 20 мин при 12000 об / мин при 4 ° C в микроцентрифуге.Осторожно извлеките пробирки из центрифуги и поместите на лед, аспирируйте супернатант и поместите в свежую пробирку на льду. Выбросьте гранулы.


Предварительная очистка лизатов

Предварительная очистка лизата может помочь уменьшить неспецифическое связывание и уменьшить фон. Однако, если окончательное обнаружение белка проводится вестерн-блоттингом, предварительная очистка может не потребоваться, если только контаминирующий белок не мешает визуализации интересующего белка.

  1. Добавьте либо 50 мкл нецелевого антитела того же вида и изотипа, что и антитело иммунопреципитации, либо нормальную сыворотку (часто предпочтительнее кроличья, см. Harlow and Lane, стр. 243) к 1 мл лизата. Инкубируйте 1 ч на льду.
  2. Добавьте к лизату 100 мкл суспензии шариков.
  3. Инкубируйте 10–30 мин при 4 ° C при осторожном перемешивании.
  4. Вращение в микроцентрифуге при 14000 x g при 4 ° C в течение 10 мин.
  5. Отбросить осадок с шариками и оставить супернатант для иммунопреципитации.

    Для увеличения выхода гранулы можно промыть еще 1 или 2 раза в буфере для лизиса, а супернатанты собрать вместе.


Важно убедиться, что удалено как можно больше нормальной сыворотки, поскольку это будет конкурировать с антителом против интересующего антигена. Чтобы проверить это, можно провести тест с буфером для лизиса вместо образца, выполнив все шаги предварительной очистки, как указано выше.

Нанесение геля из полученного супернатанта и окрашивание Кумасси покажет, эффективно ли удаляется сывороточный Ig.Если сыворотка не была удалена в достаточной степени, будут присутствовать полосы 50 и 25 кДа для тяжелых и легких цепей; его присутствие может способствовать слабой иммунопреципитации. Рассмотрите возможность уменьшения количества сыворотки или увеличения количества шариков, инкубированных с вашими образцами на этапе предварительной очистки



Иммунопреципитация

Существует несколько различных методов иммунопреципитации белков. Первый подход (метод A) заключается в смешивании антитела с образцом белка с последующим добавлением протеина A / G.Этот метод обеспечивает высокую чистоту белка; однако антитела также элюируются вместе с представляющим интерес белком, что иногда создает трудности при вестерн-блоттинге.

Второй подход (метод B) заключается в связывании антитела с гранулами белка A / G и последующем смешивании с антигеном. Этот метод дает меньший выход, чем первый, но позволяет избежать проблемы совместной элюции антител.

Метод A

Иммунопреципитация с антителами в растворе:

  1. На льду в микроцентрифужной пробирке добавьте 10–50 мкг клеточного лизата плюс рекомендованное количество антител (см. Ниже).Обычно в пилотных экспериментах фиксированное количество белка осаждается за счет увеличения количества антител.

    Рекомендуемую концентрацию антител см. В таблице данных по антителам. В качестве руководства используйте

    1–5 мкл поликлональной антисыворотки
    1 мкг аффинно очищенного поликлонального антитела
    0,2–1 мкл асцитной жидкости (моноклональное антитело)
    20–100 мкл супернатанта культуры (моноклональное антитело)

  2. Инкубируйте образец с антителом в течение 1–12 ч при 4 ° C, желательно при осторожном перемешивании или вращении.Продолжительность инкубационного периода зависит от количества белка и аффинных свойств антитела.
  3. Тем временем подготовьте шарики Sepharose. Если вы используете моноклональные антитела, выберите шарики сефарозы, связанной с G-белком. При использовании поликлональных антител обычно подходят гранулы сефарозы, связанной с протеином А (см. Таблицу «Выбор белковых шариков» ниже). Если шарики представлены в виде порошка, инкубируйте 100 мг шариков в 1 мл 0,1 М PBS, промойте в течение 1 часа, чтобы они набухли, затем центрифугируйте, удалите супернатант и выбросьте.

    Добавьте 1 мл PBS, 0,1% BSA, перемешайте в течение 1 ч, используя ротатор Eppendorf, и дважды промойте PBS. Удалите супернатант и добавьте 400 мкл буфера, содержащего ингибиторы протеаз (может быть таким же, как буфер для лизиса). Теперь суспензия готова к использованию. Может храниться при температуре 4 ° C несколько дней; в течение более длительного времени держите шарики в PBS с 0,02% азидом (тщательно промойте шарики в день использования и добавьте свежий лизисный буфер). Вы также можете купить предварительно набухшие шарики в виде готовой к употреблению суспензии.

    Рекомендуется использовать наконечники пипеток с обрезанным концом, чтобы не повредить шарики.

    При использовании антител IgM не используйте гранулы, конъюгированные с протеином A или протеином G. Используйте анти-IgM-связанные с протеином А или шарики с протеином G. Затем IgM свяжется с гранулами путем связывания с антителом против IgM.

  4. Хорошо перемешайте суспензию и добавьте 70–100 мкл шариков в каждый образец. Всегда храните образцы на льду. Бусинки будут прилипать к краям наконечника, поэтому постарайтесь свести к минимуму перемещение пипетки и используйте надрез на 5 мм от верха.
  5. Инкубируйте смесь лизатных шариков при 4 ° C и роторном перемешивании в течение 4 часов (оптимальное время инкубации можно определить в предварительном эксперименте).
  6. Выполните следующие шаги стирки.

Метод B

Иммунопреципитация с использованием конъюгата антитело-агароза:

  1. Чтобы приготовить агарозу / сефарозу с белком A или G, выполните шаг 3 метода A.
  2. Добавьте примерно 70–100 мкл суспензии белка A -, или G-, или L-агарозный конъюгат в микроцентрифужные пробирки.
  3. Добавьте 10 мкл первичного антитела. В качестве ориентира используйте разведение, рекомендованное в паспорте антител для иммунопреципитации.
  4. Инкубируйте смесь антитело-гранулы в течение 1–4 ч при 4 ° C, осторожно перемешивая смесь на подходящем шейкере.
  5. Центрифуга при 1000–3000 x g в течение 2 мин при 4 ° C и слить супернатант.
  6. Добавьте к смеси 1 мл буфера для лизиса, продолжая осторожно перемешивать, а затем центрифугируйте при 3000 x g в течение 2 минут при 4 ° C. Повторите этот этап промывки дважды.
  7. После промывания смеси гранул и антител добавьте 10–50 мкг клеточного лизата.
  8. Инкубируйте смесь конъюгата лизат-гранула / антитело при 4 ° C при роторном перемешивании в течение от 4 ч до ночи, если требуется (оптимальное время инкубации можно определить в предварительном эксперименте).
  9. По окончании инкубации продолжите промывку, указанную ниже.


Промывка

  1. Центрифугируйте пробирки, удалите супернатант с шариков и выбросьте. Теперь интересующий белок должен быть специфически связан с антителом, покрывающим гранулы.
  2. Промойте шарики промывочным буфером или буфером для лизиса трижды, чтобы удалить неспецифическое связывание. Для каждой промывки осторожно перемешайте шарики с промывочным буфером, центрифугируйте при 4 ° C и удалите супернатант.
  3. Осторожно удалите как можно больше промывочного буфера с шариков.Теперь комплекс готов к элюированию с шариков.


Элюция

Для элюирования белка из гранул можно использовать один из трех методов. Буфер SDS является самым жестким, он также элюирует нековалентно связанные антитела и фрагменты антител вместе с интересующим белком. С другой стороны, глициновый буфер мягко элюирует белок с уменьшенным количеством элюированного антитела.

Глицин Буферное элюирование

В этой процедуре комплекс элюируется из гранул путем подкисления с использованием буфера, содержащего 0.1–0,2 М глицин, pH 2,0–3,0. Низкий pH глицина ослабляет взаимодействие между антителом и шариками. Этот метод выгоден, поскольку гранулы можно повторно использовать после удаления глицинового буфера. Однако элюированный образец следует немедленно нейтрализовать трис, pH 8,0–8,5.

  1. Элюируйте шарики (50 мкл) 3 x 50 мкл 0,2 М глицина pH 2,6 (1: 1), инкубируя образец в течение 10 минут при частом встряхивании перед осторожным центрифугированием.
  2. Объедините элюат и нейтрализуйте, добавив равный объем Трис pH 8.0.

    При необходимости повторите эти шаги.

  3. Нейтрализуйте шарики, промывая 2 раза 150 мкл буфера для лизиса (без детергента) и объединяя с элюатом.
  4. Запустите образцы с помощью вестерн-блоттинга, чтобы проверить осаждение белков.

Элюция буфера SDS

Комплекс Ag-Ab элюируется из гранул путем нагревания или кипячения образцов в загрузочном буфере с денатурирующим SDS. Этот метод выгоден тем, что метод экстракции очень эффективен, а полученный образец более концентрированный.

  1. Элюируйте 50 мкл шариков путем нагревания в 50 мкл 2-кратного загрузочного буфера SDS без DTT в течение 10 мин при 50 ° C.
  2. Гранулы гранул, перенесите супернатант в новую пробирку и добавьте DTT в концентрации 100 мМ (элюция 1).
  3. Добавить 50 мкл 2 x SDS-буфера с DTT к осажденным шарикам (элюция 2).
  4. Кипятите элюированные образцы в течение 5 минут и анализируйте содержание образца методом вестерн-блоттинга. Как правило, целевой белок должен присутствовать как в элюции 1, так и в элюции 2, хотя количество в каждом будет варьироваться, и элюция 2 будет иметь больше контаминации IgG, чем элюция 1.

Буферное элюирование мочевины

Этот метод выгоден для масс-спектрометрии, поскольку образец может быть переварен протеолитическими ферментами.

  1. Промыть шарики буфером для предварительной промывки мочевины (50 мМ Трис, pH 8,5, 1 мМ EGTA, 75 мМ KCl). Удалите весь остаточный супернатант.
  2. Добавьте 2–5 объемов буфера для элюции мочевины (6–8 М мочевина, 20 мМ Tris pH 7,5 и 100 мМ NaCl) и вращайте в течение 30 минут при комнатной температуре с частым встряхиванием перед осторожным центрифугированием.
  3. Повторите этот процесс еще как минимум дважды, чтобы убедиться, что весь захваченный комплекс высвободился из гранул. Гранулы гранулы и удалить мочевину в новую пробирку.
  4. Запустите образцы с помощью вестерн-блоттинга, чтобы проверить осаждение белков.


Выбор правильных бусинок - сводная таблица


Обозначение:
+++ = сильное связывание
++ = среднее связывание
+ = слабое связывание
- = без связывания

9402 +++

Человеческий ++

3

++

3

3 9010 9040

+

90 405

+++

000

10404

Видовой изотип иммуноглобулина

Белок А

Белок G

Человеческий IgG1

++10+

++10+

++

Человеческий IgG2

+++

+++

Человеческий IgG3

-

+++

+++

Человеческий IgM

Использовать антитела против человеческого IgM


Человеческий IgE

-

+

Человеческий IgA

-


+


0

+++

Мышь IgG2a

+++

+++

Мышь IgG2b

++

++

Мышиный IgG3

+

+

Мышиный IgM

Использовать анти-мышиный IgM



Крысиный IgG2a

-

IgG2b крысы

-

++

IgG2c крысы

10 ++

10 ++

10 ++ все изотипы

-

-

Корова все изотипы

++

+++

++

Морская свинка все изотипы

+++

++

Хомяк все изотипы

10 9405
03

10 9405 904

Лошадь все изотипы

+

+++

Свинья все изотипы

+

++

Кролик все изотипы

+++

++

++

Овца

+++



Ссылки

Протоколы предоставлены Abcam «AS-IS» на основе экспериментов в лабораториях Abcam с использованием реагентов и продуктов Abcam; ваши результаты от использования протоколов вне этих условий могут отличаться.

.

Dynabeads Технология магнитной сепарации | Thermo Fisher Scientific

История магнитных бусинок Dynabeads

Dynal основан на крупном прорыве, который произвел революцию в разделении биологических материалов. В 1976 году норвежскому профессору Джону Угельстаду впервые удалось создать сферические бусины из полистирола точно такого же размера - только ранее полученные НАСА в условиях невесомости космоса. Затем последовало еще одно удивительное достижение, когда однородные бусины стали намагничиваемыми.

Продукция, типы и применение Dynabeads

Продукты

Dynabeads бывают разных размеров и с различными функциями поверхности, что позволяет использовать их в самых разных областях. Некоторые гранулы предварительно связаны с биомолекулой (лигандом), которая может представлять собой антитело, белок или антиген, зонд ДНК / РНК или любую другую молекулу, обладающую сродством к желаемой мишени. Для анализов, требующих гибкости, для вашего исследования доступен ряд продуктов Dynabeads с особыми характеристиками.

.

Смотрите также