Схема белка из бисера


Брелоки из бисера. Схемы для начинающих с пошаговыми мастер-классами. Техники плетения – Бисерок

biserok.org 30 Апрель, 2018 Из бисера

Здравствуйте! Добро пожаловать на мой мастер-класс по изготовлению брошки "Пчёлка". Материалы: -Маркер по ткани водорастворимый -Ножницы с тонкими кончиками, очень острые -Пяльцы -Круглогубцы -Иглы бисерные № 12 -Лист бумаги в клеточку -Картон -Фетр 1 мм, жесткий, белого цвета -Фетр ...

Читать дальше →

biserok.org 11 Март, 2018 Из бисера

Доброго времени суток! Если Вам это интересно, смотрите мое видео на YouTube. В этом видео я покажу как связать симпатичные пухлые губки, которые можно будет оформить в милый брелок или интересную яркую брошь. Это первая часть МК, здесь мы подробно рассмотрим процесс вывязывания губ.

Читать дальше →

biserok.org 11 Март, 2018 Из бисера

Доброго времени суток! Если Вам это интересно, смотрите мое видео на YouTube. В этом видео речь пойдет о сборке губ и оформлении их в готовое изделие.

Читать дальше →

biserok.org 28 Февраль, 2018 Из бисера

Доброго времени суток! Если Вам это интересно, смотрите мое видео на YouTube. В этом видео мы с вами начнем разговор о вязании с пайетками. На старте обвяжем бусины и соберем миниатюрные кулоны.

Читать дальше →

biserok.org 27 Январь, 2018 Из бисера

Доброго времени суток! Если Вам это интересно, смотрите мое видео на YouTube. В этом видео мы поговорим о процессе создания симпатичных кулонов/брелков. Свяжем заготовки и рассмотрим особенности сборки.

Читать дальше →

biserok.org 17 Январь, 2018 Из бисера

Доброго времени суток! Если Вам это интересно, смотрите мое видео на YouTube. В этом видео мы подробно рассмотрим процесс обвязывания бусины с бисером.

Читать дальше →

Карина Турчина 29 Август, 2015

Доброго Вам времени суток! Этот МК посвящен созданию прикольного Рыбного браслета и «минутных» рыбных брелоков) Давайте начнем! Для работы над браслетом понадобятся следующие материалы: Нитки вязальные YarnArt TULIP Крючок вязальный 0,75 мм Игла для бисероплетения (для набора ...

Читать дальше →

Карина Турчина 12 Август, 2015 Рыбка

Доброго Вам времени суток! Хочу сказать спасибо Леночке Котелевской за идею создания этих брелков и «Рыбки-клоуна»!) Этот МК посвящен плетению ярких брелков, вариаций на тему Королевских рыб-ангелов, тропических морских рыб из семейства рыб-ангелов. Длина тела этих красивых пестрых рыб ...

Читать дальше →

biserok.org 07 Август, 2015

Автор работы: Ася Леликова Меня можно описать одним словом - рукодельница. Люблю мастерить всё из всего, но бисер просто обожаю! Бисер - моя жизнь, моя работа, моя философия. Делюсь моим бисерным счастьем со всеми, кому интересно. ВКонтакте - http://vk.com/happybiser Иногда самое простое - ...

Читать дальше →

Карина Турчина 06 Август, 2015 Оранжевый, Рыбка

Доброго Вам времени суток! Думаю, после выхода мультфильма «В поисках Немо», все мы знаем ярких рыбок-клоунов, как говорится, в лицо) Удивительно, но эти симпатичные небольшие полосатые рыбы на самом деле очень храбрые! Не смотря на свои достаточно скромные размеры, рыба-клоун не побоится ...

Читать дальше →

Protein A / G Магнитные бусины | Thermo Fisher Scientific

Магнитные шарики Thermo Scientific Pierce Protein A / G обеспечивают эффективную иммунопреципитацию (IP), коиммунопреципитацию (co-IP) и очистку антител с высокой чистотой и низким уровнем фона. Эти уникальные частицы размером 1 мкм состоят из полимерного ядра, покрытого двумя слоями магнетита и запечатанного блокирующим агентом для уменьшения неспецифического связывания (Таблица 1; Рисунок 1).Поверхность гранул соединена с рекомбинантным белком A / G, который объединяет IgG-связывающие домены как белка A, так и белка G. Белок A / G обеспечивает захват иммуноглобулинов из более широкого диапазона видов и изотипов антител, чем белок A или белок. G один. Гранулы можно использовать как вручную с магнитной подставкой, так и с автоматическими платформами, такими как Thermo Scientific KingFisher Instruments.

Таблица 1.Характеристики магнитных шариков Thermo Scientific Pierce Protein A / G

Состав Заблокированные частицы оксида железа, ковалентно покрытые монослоем белка A / G
Диаметр 1 мкм
Концентрация 10 мг / мл
Переплет 55-85 мкг кроличьего IgG / мг магнитных частиц
88802-ProteinAGMag-001-469px

Рисунок 1.Схема магнитных шариков Thermo Scientific Pierce Protein A / G.

Магнитные шарики Pierce Protein A / G могут использоваться для очистки антител от биологических жидкостей, таких как сыворотка. По сравнению с магнитными шариками с протеином A и протеином G от других поставщиков, магнитные шарики Pierce A / G очищают значительно больше антител из кроличьей (рис. 2A) и мышиной (рис. 2B) сыворотки с меньшим фоном.Кроме того, магнитные шарики Pierce A / G обладают в четыре раза большей связывающей способностью (на миллиграмм шариков) для очищенного кроличьего IgG, чем магнитные шарики от другого поставщика (рис. 3).

88802-ProteinAGMag-002-stacked

Рисунок 2. Выделите больше IgG из кроличьей и мышиной сыворотки с меньшим фоном.Используя KingFisher Flex с 96-луночным планшетом с глубокими лунками, IgG очищали из кроличьей (панель A) и мыши (панель B) сыворотки (5 мг общего белка) с использованием 50 мкл магнитных шариков Pierce Protein A / G и магнитных шариков с белками A и G. бусы от других поставщиков. Гранулы промывали трис-забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% детергента Tween 20 (TBST), инкубировали 1 час с сывороткой, разбавленной в TBST, промывали трижды и элюировали 0,1 М глицином, pH 2,8, в течение 10 минут при комнатной температуре. Элюаты разделяли с помощью SDS-PAGE и окрашивали красителем Thermo Scientific Imperial Protein Stain (кат.№ 24615). Полосы тяжелой цепи IgG количественно определяли денситометрией. Значения для каждого набора повторяющихся полос усредняли и выражали как процент от среднего для гранул Pierce Protein A / G.

88802-ProteinAGMag-003-455px

Рисунок 3.Связывающая способность кроличьих IgG магнитных шариков Thermo Scientific Pierce Protein A / G примерно в четыре раза выше, чем у магнитных шариков от ведущего поставщика. Магнитные гранулы Pierce Protein A / G и магнитные гранулы Protein A и Protein G от другого поставщика добавляли в 96-луночный планшет (гранулы по 1 мг на лунку). Используя прибор KingFisher 96, шарики промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,05% детергента Tween 20 (PBST), и инкубировали в течение 1 часа с различными количествами очищенного кроличьего IgG (20-200 мкг).После связывания шарики трижды промывали PBST и элюировали при 96 ° C восстанавливающим буфером для образцов SDS-PAGE. Связывание рассчитывали путем вычитания количества протеина в проточном потоке из загруженного количества с использованием анализа протеина BCA Thermo Scientific Pierce (каталожный номер 23225).

Набор Pierce Classic Magnetic IP / Co-IP Kit обеспечивает эффективную иммунопреципитацию целевого белка из клеточных лизатов (рис. 4).Этот набор также может эффективно изолировать интактные белковые комплексы и белки co-IP, которые связаны с целевым белком. Например, IP Cdk1 будет совмещать с IP циклином B, если ячейки синхронизированы в поздней фазе G2. Магнитные шарики Pierce Protein A / G коиммунопреципитировали циклин B из клеточного лизата U2OS с таким же или более высоким выходом, чем шарики с протеином A и G от других поставщиков (рис. 5A). Окрашивание серебром элюатов гранул выявило незначительный фон (за исключением антител) для всех тестируемых гранул (рис. 5В).

88804-ProteinAGMag-004-467px

Рис. 4. Набор Thermo Scientific Pierce Classic Magnetic IP / Co-IP Kit эффективно иммунопреципитирует Cdk1. Клетки U2OS (остеосаркомы человека) синхронизировали в поздней фазе G2 путем сывороточного голодания с последующим ростом в 20% фетальной бычьей сыворотке в течение 18 часов до сбора урожая.Клетки лизировали в буфере для лизиса / промывки IP, и 0,75 мг лизата (на образец) инкубировали с антителом против Cdk1 и без него в течение ночи при 4 ° C. Магнитные гранулы Pierce Protein A / G и магнитные гранулы Protein A и Protein G от трех поставщиков добавляли (по 50 мкл каждый) в 96-луночный планшет. Используя прибор KingFisher Flex, шарики промывали буфером для лизиса / промывки IP, инкубировали в течение 1 часа со смесью образец антиген / антитело, дважды промывали буфером для лизиса / промывки IP, содержащим 0,5 M NaCl, один раз промывали водой и элюировали SDS. -PAGE восстанавливающий буфер для образца в течение 10 минут при комнатной температуре.Элюаты разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали вестерн-блоттингом на Cdk1. Магнитные шарики Pierce Protein A / G были способны эффективно IP Cdk1 с более высоким выходом, чем шарики от других поставщиков.

88804-ProteinAGMag-006-483px

Рис. 5. Набор для магнитного IP / Co-IP от Thermo Scientific Pierce Classic эффективно коиммунопреципитирует циклин B и Cdk1.Клетки U2OS синхронизировали, и образцы готовили, как описано на фиг. 3. Элюаты разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали вестерн-блоттингом (панель A) на циклин B или окрашивание серебром (панель B). Гранулы Pierce Protein A / G были способны эффективно взаимодействовать с IP-циклином B с выходами, превышающими или равными гранулам от других поставщиков. Бусины Pierce связывали такое же или большее количество антител, чем магнитные бусины с протеином A и G от других поставщиков (панель B). Все бусины имели незначительное неспецифическое связывание.

.

% PDF-1.4 % 2073 0 объект > endobj xref 2073 47 0000000016 00000 н. 0000002138 00000 п. 0000002301 00000 п. 0000002881 00000 п. 0000003507 00000 н. 0000003693 00000 н. 0000004275 00000 н. 0000004454 00000 п. 0000004493 00000 н. 0000004608 00000 н. 0000004721 00000 н. 0000004814 00000 н. 0000005282 00000 п. 0000005833 00000 н. 0000006415 00000 н. 0000007057 00000 н. 0000008272 00000 н. 0000008461 00000 п. 0000008757 00000 н. 0000009055 00000 н. 0000010227 00000 п. 0000011430 00000 п. 0000012783 00000 п. 0000013122 00000 п. 0000013314 00000 п. 0000013646 00000 п. 0000014036 00000 п. 0000015262 00000 п. 0000016578 00000 п. 0000017894 00000 п. 0000019079 00000 п. 0000019199 00000 п. 0000022992 00000 п. 0000028055 00000 п. 0000028745 00000 п. 0000030143 00000 п. 0000030500 00000 п. 0000030947 00000 п. 0000031227 00000 н. 0000031525 00000 п. 0000040145 00000 п. 0000040186 00000 п. 0000047912 00000 п. 0000047953 00000 п. 0000049916 00000 н. 0000001921 00000 н. 0000001266 00000 н. трейлер ] / Назад 1217193 / XRefStm 1921 >> startxref 0 %% EOF 2119 0 объект > поток hb``ʻe``c`c`> ̀

.

Продукты Dynabeads для иммунопреципитации | Thermo Fisher Scientific

Шаг 1: Связывание антитела с шариками

Связывание антитела с шариками. Магнитные шарики Dynabeads предварительно покрыты протеином A, протеином G, антителами против мышиного IgG или кроличьего IgG, и благодаря быстрой кинетике они связывают добавленные антитела всего за 10 минут. Биотинилированные антитела также можно использовать в сочетании со стрептавидином Dynabeads.Один раз промойте шарики на магните, чтобы удалить несвязанные антитела.

Шаг 2: Добавьте образец к бусинам

Добавьте образец к бусинам. Добавьте белок, содержащий образец, к промытым шарикам со связанным антителом и инкубируйте еще 10 минут для связывания целевого белка, представляющего интерес. Если белок имеет низкое содержание или низкое сродство, инкубацию можно увеличить до 1 часа или до инкубации в течение ночи; но в целом достаточно 10-минутной инкубации.

Шаг 3. Промойте связанные с белком шарики

Вымойте связанные с белком шарики. Для обеспечения высокой чистоты связанного целевого белка шарики необходимо 2–4 раза промыть буфером на магните для удаления всех несвязанных белков. Эффективный процесс изоляции обеспечивает высокое отношение сигнал / шум.

Шаг 4: элюируйте белок

Элюируйте белок. При необходимости белок можно элюировать с гранул, используя либо процедуру мягкого элюирования, либо процедуру денатурирующего элюирования (подробности см. В описании элюирования ниже).

.

Рассчитайте количество иммобилизованных белков на бусину поддерживающих аффинных средств агарозы | Thermo Fisher Scientific

Исследования в области биологии белков, как мы знаем, были бы невозможны без разнообразных хроматографических смол, шариков, мембран, пластиковых поверхностей и других твердых или пористых материалов для иммобилизации белков и аффинных лигандов. Поскольку эти инструменты и методы являются лишь средством для достижения цели, а не основным направлением исследований, исследователям легко упускать из виду относительные молекулярные, макромолекулярные и физические масштабы, участвующие в используемых процессах.В определенном смысле те из нас, кто рассказывает о химических реакциях, которые составляют основу очистки и обнаружения белков, виновны в сохранении ложных представлений и представлений о масштабах. Например, следующая иллюстрация (рис. 1) одновременно очень информативна в отношении химических реакций, происходящих во время иммобилизации антитела, и вводит в заблуждение относительно относительных размеров компонентов в реакции.

A14n04-Fig1 Рисунок 1.Схема иммобилизации антител на гранулированной агарозной смоле. Этот пример иллюстрирует реакции, участвующие в связывании антител с связывающей смолой Thermo Scientific AminoLink Plus (деталь № 20501). Смола представляет собой активированную альдегидом агарозу в виде гранул, к которой антитела, другие белки и молекулы могут быть ковалентно присоединены через их первичные амины. В результате этой реакции образуется аффинная смола многоразового использования для использования в различных методах очистки.

С целью передачи ключевых особенностей механизма иммобилизации на таких иллюстрациях показаны размеры функциональных групп и опор с бусинами, сжатых или сжатых до одного порядка величины, даже несмотря на то, что истинные молекулярные размеры функциональных элементов фактически охватывают почти шесть порядков величины. (Таблица 1).Рисунок 2 обеспечивает более точное представление размеров, используемых при работе с макромолекулами, имеющими диаметр в диапазоне низких нанометров, по сравнению с пористыми смолами, имеющими диаметры в диапазоне микрон. На этой иллюстрации невозможно даже увидеть отдельные функциональные группы и атомы, поскольку они почти в сто раз меньше, чем иммобилизуемые макромолекулы.

Таблица 1. Относительные размеры функциональных групп на диаграммах иммобилизованных аффинных лигандов.
Группа Размер (диаметр или длина) Порядок величин
Гранулы агарозы † от 45 до 165 мкм (100 мкм) 10 -4 метров
Белок (антитело) от 10 до 12 нм (11 нм) 10 -8 метров
Химическая связь (C-N) от 0,13 до 0,15 нм (0,14 нм) 10 -10 метров
† Исходным отраслевым стандартом и источником агарозы в гранулах для производства аффинных носителей, используемых в лабораториях, были среды Sepharose ™ 4B, 6B, CL4B и CL6B от GE Healthcare.Несколько производителей теперь производят эквивалентные смолы.
A14n04-Fig2

Рис. 2. Диаграмма относительных размеров гранул агарозы и антител (белков).

В отличие от таких диаграмм представлены фактические характеристики загрузки лиганда и связывающей способности, которые описывают концентрацию иммобилизованных лигандов или белков относительно приготовленных аффинных смол.Обычно они указываются как масса связанного лиганда (миллиграммы, мг) или как концентрация связанного лиганда (микромоль, мкмоль или иногда даже наномоль, нмоль) лиганда на миллилитр (мл) осевшей агарозной смолы (Таблица 2) .

Таблица 2. Примеры характеристик загрузки и / или связывающей способности выбранных смол сродства к агарозе.

Значения являются заявлениями о продукте или спецификациями испытаний и выражены на миллилитр осевших шариков, как в упакованной аффинной колонке объемом 1 мл.См. Подробности на соответствующих страницах продукта.

Thermo Scientific Product Нагрузка лиганда Обвязка или сцепная способность
Смола для связки AminoLink Plus Не сообщается От 1 до 20 мг антител (IgG)
Агароза, активированная NHS Не сообщается > 25 мг человеческого IgG
Смола SulfoLink Не сообщается > 5 мг сниженный IgG человека
Иммобилизирующая смола CarboxyLink > 16 мкмоль амина 0.От 5 до 1 мг пептида
HisPur Ni-NTA агароза > 15 мкмоль никель До 60 мг His-GFP (27 кДа)
Пирс Глутатион Агароза Не сообщается > 40 мг очищенного GST;
10 мг GST-меченых белков
Пирс Стрептавидин Агароза Не сообщается от 15 до 28 мкг биотина;
от 1 до 3 мг биотинилированного BSA
Pierce Protein A / G Агароза Не сообщается > 7 мг человеческого IgG

Для исследователя, желающего представить более точную картину основных молекулярных и физических размеров, содержащихся в иммобилизованной аффинной смоле, поучительно рассчитать, как значения загрузки лиганда и связывающая способность соотносятся с количеством и размером отдельных молекул.В этой статье мы представляем расчеты, необходимые для ответа на следующие вопросы:

  • Каков объем одной гранулы агарозы?
  • Сколько гранул агарозы в одном миллилитре осевшей смолы?
    (Какое количество шариков агарозы на миллилитр уплотненной смолы?)
  • Сколько функциональных групп содержится в бусине агарозы?
    (Какое количество функциональных групп на шарик?)
  • Сколько молекул антитела или белка связано с одной гранулой агарозы?
  • Сколько молекул антитела или белка может связываться с одной бусиной агарозы?

Количество гранул агарозы на миллилитр осевшей смолы

Первый шаг в преобразовании концентрации (например,(например, мкг лиганда на мл осевших шариков) к количеству молекул лиганда на шарик - для определения количества шариков на миллилитр уплотненной смолы. Было бы идеально определить это значение эмпирическим путем, аналогичным способу подсчета клеток: сделайте известное разбавление измеренного объема осевших шариков, а затем подсчитайте шарики в образце под микроскопом. Нам не удалось найти опубликованные результаты этого типа измерений. Поэтому наш подход состоит в том, чтобы рассчитать средний объем шариков, а затем использовать теорию упаковки сфер в качестве основы для оценки количества этих шариков в одном миллилитре смолы.

  1. Гранулы агарозы имеют диаметр от 45 до 165 мкм.
    • Предположим, что шарики представляют собой сферы диаметром 100 мкм.
    • Это означает, что средний валик имеет радиус 50 мкм = 0,05 мм = 0,005 см
  2. Таким образом, объем одной бусинки составляет:
    • Объем шара = (4/3) πr 3
    • Для радиуса = 0,005 см объем отдельного валика = 5,236 x 10 -7 см 3 = 5,236 x 10 -7 мл
    • Для тех, у кого действительно крошечный дозатор, это объем 0.524нЛ!
    • Таким образом, для всей совокупности шариков индивидуальный объем шариков находится в диапазоне от 0,047 нл (для шариков диаметром 45 мкм) до 2,3 нл (для шариков диаметром 165 мкм).
  3. Теория упаковки сфер:
    • Формулы показывают, что сферы упаковываются с эффективностью от 65 до 75% (http://en.wikipedia.org/wiki/Sphere_packing).
    • Агароза в гранулах - это смесь гранул разных размеров, причем гранулы не являются ни идеально сферическими, ни твердыми; как таковая теория упаковки сфер может дать лишь приблизительную оценку истинного значения числа частиц в данном объеме.Однако для наших целей этого более чем достаточно.
    • Другими словами, если предположить, что эффективность насадки 75%, 0,75 мл фактического объема гранул осядет с образованием примерно 1 мл объема слоя (например, 1 мл смолы в колонке).
  4. Окончательный расчет:
    • Количество шариков в мл:
    • = 0,75 (1 шарик / 5,236 x 10 -7 мл)
    • = 1,432 x 10 6 шариков / мл слоя
    • = прибл. 1,4 миллиона шариков на миллилитр смолы

Число функциональных или реактивных групп на гранулу агарозы

  1. Активированные смолы производятся с содержанием групп от 10 до 100 мкмоль на мл уплотненной смолы.
    • Например, смола CarboxyLink производится с содержанием аминов 16-20 мкмоль на мл упакованных шариков (слой смолы)
    • Мы сделаем расчет только для 1 мкмоль на мл слоя смолы (= 1 x 10 -6 моль).
    • Таким образом, количество молекул равно количеству молей, умноженному на число Авогадро: (1 x 10 -6 моль) x (6,02 x 10 23 ) = 6,02 x 10 17 молекул на мл смолы. постель.
  2. Окончательный расчет:
    • 1 мкмоль аффинных групп на мл слоя смолы:
    • = (6.02 x 10 17 групп на мл слоя смолы) / (1,432 x 10 6 гранул на мл слоя смолы)
    • = 4,204 x 10 11 групп на борт
    • = прибл. 420 миллиардов групп на бусину агарозы
  3. Следовательно:
    • Мы можем с уверенностью сказать, что для типичных активаций, когда шарики содержат от 20 до 40 мкмоль реактивных групп на мл смолы:
    • На гранулу агарозы приходится триллионы активных групп

Число иммобилизованных молекул антител на гранулу агарозы

  1. Как правило, связывающая способность активированных смол с белками определяется эмпирически с помощью примеров экспериментов (часто с использованием цельного IgG мыши или кролика).Обычно эти связывающие способности выражаются в микрограммах или миллиграммах белка на миллилитр смолы.
    • Например, эксперименты показывают, что 1 мл связывающей смолы AminoLink Plus (деталь № 20501) может иммобилизовать 4,7 мг мышиного IgG с эффективностью 97%. Это означает, что эффективный выход связывания составляет 4,5 мг IgG на мл смолы.
    • Давайте упростим и будем консервативными, сделав расчет только для 1 мг IgG, фактически связанного на мл слоя смолы.
    • ММ IgG = 150 000 г / моль; следовательно, 1 мг IgG = 6.67 x 10 -9 моль
    • Это количество молей, умноженное на число Авогадро, равно 4,01 x 10 15 молекул IgG на мл слоя смолы.
  2. Окончательный расчет:
    • 1 мг IgG на мл слоя смолы:
    • = (4,01 x 10 15 молекул IgG на мл слоя смолы) / (1,432 x 10 6 шариков на мл слоя смолы)
    • = 2,80 x 10 9 молекул IgG на шарик
    • = почти 3 миллиарда молекул антител на гранулу агарозы
  3. Следовательно:
    • Можно с уверенностью сказать, что для типичных процедур иммобилизации белков
    • На бусину агарозы попадают миллиарды белковых молекул

Количество связанных белковых молекул на гранулу агарозы

  1. Связывающая способность, как и способность ковалентного связывания, обычно выражается в миллиграммах связанного белка-мишени на миллилитр аффинной смолы.
    • Например, Ni-NTA и кобальтовые смолы Thermo Scientific HisPur обладают статической связывающей способностью для белков, меченных His, от 10 до 50 мг / мл смолы. Тестирование проводится с использованием His-GFP (27 кДа).
    • Давайте сделаем расчет для 10 мг слитого белка His-GFP на мл слоя смолы.
    • His-GFP MW = 27000 г / моль; следовательно, 1 мг His-GFP = 3,7 x 10 -8 моль
    • Это количество молей, умноженное на число Авогадро, равно 2,23 x 10 17 молекул His-GFP на мл слоя смолы.
  2. Окончательный расчет:
    • 10 мг слитого белка с меткой His на мл слоя смолы:
    • = (2,23 x 10 17 молекул His-GFP на мл слоя смолы) / (1,432 x 10 6 шариков на мл слоя смолы)
    • = 1,56 x 10 11 молекул His-GFP на шарик
    • = 156 миллиардов молекул His-GFP на гранулу агарозы
  3. Следовательно:
    • Можно с уверенностью сказать, что для многих процедур очистки белка
    • Многие миллиарды белковых молекул связываются на гранулах агарозы

Есть еще одно очень важное соображение при попытке правильно визуализировать процесс аффинной очистки в масштабе отдельных гранул агарозы.Гранулы агарозы не твердые, твердые и непроницаемые; скорее, они представляют собой высокопористый аэрогель с сетчатыми структурами, состоящими из слабо переплетенных полисахаридных нитей в спиральных структурах. Следовательно, лиганды и типичные белковые молекулы могут диффундировать в матриксе, присоединяться и связываться по всему объему гранулы агарозы. Другими словами, крепление не ограничивается областью внешней поверхности.

Гранулы из стандартных 4% или 6% гранулированных агарозных смол (доступные от многих поставщиков) имеют диаметр от 45 до 165 мкм, что примерно в 5000–50 000 раз превышает длину или ширину глобулярных белков антител и других белков.Хотя схемы методов ковалентной иммобилизации поучительны для описания химической основы реакций сочетания, они вводят в заблуждение относительно относительных размеров и количества задействованных функциональных групп. С помощью нескольких простых вычислений мы сделали необходимые преобразования единиц, чтобы выразить примерные значения концентрации (уровни активации, уровни загрузки, связывающая и связывающая способности) в терминах числа молекул на отдельные гранулы агарозы. Возможно, для большинства исследователей знание этих ценностей удовлетворяет чисто академическое любопытство и не имеет практической ценности.Тем не менее, мы полагаем, что в целом для ученых полезно поддерживать точные представления о молекулярной динамике лабораторных методов.

Сводка результатов:

  • В подложках из агарозы с 4% или 6% гранул средний объем сферических гранул агарозы составляет около половины нанолитра (0,52 нл).
  • В одном миллилитре (1 мл) осевшей агарозной смолы содержится примерно 1,5 миллиона отдельных гранул агарозы.
  • В типичных носителях с активированным сродством, используемых для ковалентной иммобилизации, каждая отдельная гранула агарозы содержит триллионы (1 x 10 12 ) функциональных или реактивных групп (например,g., альдегиды, амины, сложные эфиры NHS и т. д.).
  • В типичных аффинных носителях для очистки белков каждая отдельная гранула агарозы способна взаимодействовать или связываться с миллиардами (1 x 10 9 ) целевых молекул (например, белков, антител и т. Д.).
Таблица 3. Сводка расчетных значений для агарозных носителей с гранулами.
Параметр Значение
Средний размер валика (диаметр) 100 мкм
Сферическая бусина, объем среднего борта 5.0 x 10 -10 л (0,5 нл)
Количество шариков агарозы на миллилитр осевшей смолы 1,5 x 10 6 (1,5 миллиона)
Количество функциональных реактивных групп на валик > 1 x 10 12 (> 1 триллион)
Количество аффинно связанных белков на гранулу > 1 x 10 9 (> 1 миллиард)
.

Смотрите также